Proteinlerin Kantitaif Tayini

Proteinler bir çok fonksiyonu gerçekleştiren önemli biyomoleküllerdir.

Proteinlerin önemli görevleri arasında ;
-Enzimatik kataliz (enzimler)
-Taşıma (hemoglobin)
-Depolama (ferritin)
-Yapı ve destek gibi mekanik fonksiyonlar (kollagen)
-Hareket (aktin ve miyosin)
-Koruma (antikorlar)
-Düzenleme (hormonlar ve reseptörler)
-Gen regülasyonu (represörler)               sayılabilir.

Proteinler birçok şekilde sınıflandırılabilir. Örneğin proteinler yapısal içeriklerine göre basit proteinler ve bileşik proteinler olmak üzere ikiye ayrılır. Histonlar gibi basit proteinler sadece aminoasitlerden olusurken ; hemoglobin ve miyoglobin gibi bileşikler aminoasitler ve aminoasit harici yapılar içerirler.
Proteinler konformasyonlarına göre de sınıflandırılabilirler.
Konformasyonlarına göre proteinler fibröz proteinler, globüler proteinler ve fibroglobüler proteinler olmak üzere 3 ana sınıfa ayrılabilir. Kollagen ve keratin gibi fibröz proteinler ipliksi yapıdadırlar, suda ve seyreltik tuz çözeltilerinde çözülmezler, genellikler destek ve yapı gibi mekanik fonksiyonlara sahiptirler.
Enzimler ve hemoglobin gibi globüler proteinler küresel veya küreye yakın yapıdadırlar, suda ve seyreltik tuz çözeltilerinde çözünürler ve enzimatik kataliz,taşıma gibi dinamik fonskiyonlara sahiptirler.
Fibrinogen ve miyozin gibi fibroglobüler proteinler ise ipliksi yapıda olmalarına rağmen suda ve seyreltik tuz çözeltilerde çözünürler ve çeşitli fonksiyonlara sahiptirler.

Bir numunedeki protein miktarının tayini için bir çok metot vardır. Kjeldahl Metodu, Warburg Metodu (UV Absorbsiyon metodu), Comassie-Blue Metodu (Bradford Metodu), Biüret Metodu ve Folın-Lowry Metodu bu metodların en önemlilerindendir.

Kantitatif protein tayin metodlarının en eskilerinden birisi, protein yapısındaki azot mikarını ölçmeye yarayan ve yüksek miktarlardaki numunelerin çalısılmasını gerektiren Kjeldahl Metodudur.

Azot analiz yöntemleri genelde dört önemli azot formu ile ilgilidir. Bunlar amonyak azotu, nitrat azotu, nitrit azotu ve organik azot formları olup yüzeysel sularda ve kirletilmiş sularda ölçülmesi gereken azot şekilleridir.
Organik azot analizinde genelde Kjeldahl metodu uygulanır. Özel proses atığı  sularda evsel atıklarda olan polipeptit ve aminoasitler bu yöntemle analizlenebilir.
Yöntemde çeşitli oksitleyici koşullarda organik bileşikteki azotu NH3’ e dönüştürmekle işe başlanır. Oksidasyon derişik H2SO4 ile bu asidin kaynama  noktasının üzerindeki bir sıcaklıkta 340 °C yapıldığından asidin K.N.’nın K2SO4 potasyum sülfat eklenerek yükseltilmesi gerekmektedir.
Reaksiyonun bitmesi suyun buharlaşıp, sülfrik asit buharlarının çıkmaya başladığından, organik maddelerin parçalanarak karbondioksit olarak çıkmasından 20 dk sonra (bulanıklığın giderek berraklaşması) olur. Bu durumunda tüm azotlu bileşikler NH3’ e dönüştüğünden, önce H2SO4 ‘ün fazlası fenolftalein indikatörü
kullanılarak nötralize edilir.
Daha sonra pH 7 civarında suda kalan amonyak azotu normal amonyak tayin yöntemi ile belirlenir.

Yukarıda bahsedilen diğer metodlar ise ışığı absorplayabilen spesifik amino asit yan gruplarını, peptid bağlarını veya proteine özel bir boyaya bağlanmayı gerektiren spektrofotometrik işlemlere dayanmaktadır.
Spektrofotometrik işlemler protein çözeltisinin UV absorbsiyonunun ölçülmesine veya çözeltideki protein ile bir reaktifin reaksiyonu sonucunda oluşan renkli bir bileşiğin absorbiyonunun görünür bölgede ölçülmesine dayanır.

Warburg Metodu, kromatografik işlemlerden elde edilen elüatlarda bulunan protein miktarını 280nm dalga boyunda UV/Visible spektrofotometre ile dogrudan ölçmeye dayanır.
Kantitatif protein tayinlerinde en sık kullanılan metodlar Comassie-Blue ile Biüret metodlarıdır.
Comassie-Blue metodu , proteine bağlanan Comassie-Blue boyasının 595 nm' de verdiği absorpsiyonun spektrofotometrik olarak ölçülmesine dayanır.

Biüret Metodu , alkali ortamda Cu(+2) iyonunun iki peptid molekülü ile verdiği renkli kompleksin 546 nm' de verdiği absorbansın spektrofotometrik olarak ölçülmesine dayanır.

1-20 mg/ml hassasiyette çalışan bu yöntem, alkali koşullar altında Cu2+ iyonlarının amonyum,aminoasitler, peptidler, proteinler ve biüretler gibi amonyumlu bileşiklerle mavi-mor renkli kompleks oluşturması esasına dayanır. Protein ve peptidlerde iki peptid bağı oluşumuna katılan 4 azot atomu ile biüret ayıracından gelen Cu2+nin renkli kompleks oluşturması esastır. Oluşan bu kompleks 540-560 nm dalga boyunda maksimum absorbans verir.

Biüret bileşiği yapı olarak peptid bağına benzer bir maddedir ve Cu2+iyonları ile proteinlerin verdiği reaksiyona benzer bir renkli kompleks oluşturur. Bu nedenle kullanılan yönteme Biüret Yöntemi, Cu2+içeren çözeltiye de Biüret Ayıracı adı verilir.

Amino asitler ve dipeptidler Biüret Metodunda kullanılan Biüret Reaktifi ile reaksiyon vermezler.

Folin -Lowry Metodu, alkali koşullar altında Biüret reaksiyonu ve aromatik aminoasitlerin (Tirozin,Triptofan) Cu2+ katalizli oksidasyonundan sonra, ayıraçta bulunan Fosfomolibdik, Fosfotungstik asit ile heteropolimolibden mavisine indirgenmeyi içeren Folin-Ciocalteu reaksiyonunun bir kombinasyonudur.Koyu mavi renk oluşumu karakteristiktir ve 750 nm dalga boyunda maksimum absorbans verir. Yöntem çok duyarlıdır (5 mg/ml), ancak pH’ya bağımlıdır.