YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMOTOGRAFİSİ(HPLC)
GENEL BİLGİ ve ÇALIŞMA PRENSİBİ
Yüksek Performans Sıvı Kromotografisi (HPLC) yöntemi bir sıvıda çözünmüş bileşenlerin, bir kolon içerisinde bulunan genellikle katı bir destek üzerindeki sabit faz ile değişik etkileşimlere girmesi, kolon içinde değişik hızlarla hareket etmeleri sonucu, farklı zamanlarda bileşenlerin kolonu terk ederek birbirlerinden ayrılması temeline dayanır. (1)
Yaygın kullanılma sebepleri;
- Duyarlılığı, kantitatif tayinlere kolaylıkla uyarlanabilir
- Uçucu olmayan veya sıcaklıkla kolayca bozunabilen bileşiklerin ayrılmasına uygunluğudur.
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisinin başlıca kullanıldığı alanlar;
- İlaçlar (Antibiyotikler, sedatifler, streoitler, analjezikler),
- Biyokimyasallar (Amino asitler, proteinler, karbonhidratlar, lipidler),
- Gıda maddeleri (Suni tatlandırıcılar, antioksidanlar, aflatoksinler, katkı maddeleri),
- Endüstriyel kimyasallar (Çok halkalı aromatikler, yüzey aktif maddeleri, iticiler, boyalar),
- Kirleticiler (Pestisitler, herbisitler, fenoller, PCB’ler),
- Klinik tıp (Safra asitleri, ilaç metabolitleri, üre özütleri, östrojenler),
- Uyuşturucular (Uyuşturucu ilaçlar, zehirler, kan alkolü, narkotikler)’ dır.
Günümüzde özellikle ilaç sektöründe elzem bir cihaz haline gelmiştir. Kullanılan metotlar akabinde uygulanan analizlerde (miktar tayini, impirüte vb.) çoklukla kullanılır. İlaç̧ endüstrisini baz aldığımızda, dozaj formlarında bulunan aktif bileşenin kalite kontrolü̈ hayati önem taşımaktadır.
HPLC sistemi bu aktif bileşen veya dozaj formunun içerisinde bulunan, ilacın sentezlenmesinden veya bozunmasından kaynaklanan safsızlıkların tespiti için kullanılabilir. Bu noktada yapılan kalite kontrol hastanın güvenliğini sağlamaktadır.
Yüksek Performanslı Sıvı Kromotografisi (HPLC) bir sıvıda çözünmüş bileşenlerin, bir kolon içerisinde bulunan genellikle katı bir destek üzerindeki sabit faz ile değişik etkileşimlere girmesi, kolon içinde değişik hızlarla hareket etmeleri sonucu, farklı zamanlarda bileşenlerin kolonu terk ederek birbirlerinden ayrılması temeline dayanır (2).
HPLC, genellikle ayırma mekanizmasına veya durgun fazın (kolon) tipine göre sınıflandırılır. Bunlar arasında dağılma ya da sıvı-sıvı kromatografi, adsorpsiyon ya da katı-sıvı kromatografi, iyon-değişimi kromatografi, boyut ayırıcı kromatografi, afinite kromatografi ve kiral kromatografiyi sayabiliriz (2).
Şekil-1: Sıvı kromatografinin uygulamaları.
- Diyagramın sağ tarafındaki kromatografi tipleri, polar bileşikler için uygundur. Diyagramın altındaki teknikleri ise, büyük mol kütleli türler için en uygundur. (2)
Modern cihazlarda normal bir akış hızı elde etmek için, 3-10 µm’lik dolgu maddeleriyle doldurulmuş kolonlarda birkaç yüz atmosferlik basınç uygulamaları yapılır (2).
HPLC’nin en büyük avantajı ısıya dayanıklı olmayan ve uçucu olmayan bileşikleri analiz edebilmesidir. Ayrıca, yüksek basınç nedeniyle analiz süresinin azalması, kesin sonuca ulaşma, düşük oranlarda miktar saptama, analizlerin oda sıcaklığında yapılması sistemin diğer avantajları arasında sayılabilir (2).
HPLC’nin avantajları olduğu gibi dezavantajları da bulunmaktadır. Bu, yüksek basınç uygulaması nedeniyle, diğer kromatografi cihazlarına göre daha pahalı ve daha karışık olmasıdır (2).
HPLC CİHAZININ KISIMLARI
Cihazın temel modülleri, çözücü (hareketli faz) rezervuarı, pompa, enjeksiyon valfı, kolon, dedektör, kaydedici ve atık rezervuarıdır. Bu modüllere ek olarak, çeşitli sistemlerde bazen çözücü filtresi, örnek filtresi, ön kolon filtresi, koruyucu kolon, basınç düzenleyicisi ve çözücüler için gaz geçirme sistemi (degasser) de yer alabilir (2).
HPLC’nin temel çalışma prensibine göre, detektör çözücü ve çözelti arasındaki karakteristik değişiklikleri ölçer. Bu değişiklikler monitörde görüntülenir. Diyagramda; çözücünün geçtiği bölüm, örneği sabit bir akış hızıyla cihaza iter. Enjektör, örneği sıvının içinden geçtiği kolona alır. Kolon, araştırılan maddeyi örnekteki diğer maddelerden ayıran silikon boncukların bulunduğu paslanmaz çelikten yapılmış tüptür. Dedektör, çözeltideki değişiklikleri belirleyen optik sensördür. Monitör, sistem elemanlarının kontrolünü, verilerin kaydedilmesini sağlar (2).
Şekil 2. HPLC Cihazının Kısımları
HPLC POMPA SİSTEMLERİ
Analitik HPLC kolonları çok düşük çapa sahip sabit faz parçacıkların (1.7-5 mikrometre) metal yapıda silindirlerin içine doldurulması ile üretilir. Amaç bu kolonların içine verilecek olan analitlerin uygun bir polariteye sahip mobil faz beslemesi ile ayrılmasını sağlamaktır. Söz konusu hareketli fazın bu kolonlardan istenilen akış hızında geçebilmesi için çok güçlü pompa sistemleri olmalıdır. Böylece gerekli ön basıncı sağlanabilir. Bu pompa sistemleri genel olarak HPLC pompaları olarak adlandırılır. Firmalar arası rekabetten dolayı çok farklı varyasyonlarda üretilseler de temel olarak 3 farklı çeşit olarak üretilirler. Bu temel anlayışlar üzerinden üretim ve geliştirme yapılarak diğer modifikasyonlar piyasaya sürülmüştür (3).
Şekil 3. Temel Pompa Sistemi
Temel olarak sistem; bir pompa başı içinde ileri geri hareketlerle emme-basma tulumba prensibi ile çalışan iki adet pistonun hareketi prensibine dayanır. Bu pistonları, pompa başına entegre biçimde konuşlandırılmış olan sıvının tek yönlü hareketini sağlayan giriş ve çıkış vanaları destekler. Aynı zamanda bu pistonların hem hareketinin rahat olmasını sağlayan hem de yüksek basıncı içinde hapsedecek yüksek basınç contaları vardır. Pistonlar emme-basma işlemini bu pistonların içinde yapar (3).
Pistonlar genellikle safir ya da safire benzer, yüzey gözenek oranı çok düşük ve sertliği yüksek olan malzemelerden üretilir. Böylece konvansiyonel olarak çok yüksek (400 bar gibi) basınçlara ulaşılabilir. Normal şartlar altında pompa pistonlarının hareketinden dolayı kesikli akış elde edilir ki bu istenmeyen bir şeydir. Çünkü akış istenen ölçüde sabitlenemez ise istenen akış programlaması da yapılamaz ve analitlerin ayrışımı ve tanımlanması güçleşir. Bu duruma farklı disipliner anlayışlar farklı çözümler getirerek sonuca ulaşmışlardır (3).
En bilineni damper denen ek bir parçanın akış yolu üzerine entegre edilmesi ile basıncın ve akışın dengelenmesidir. Bir diğer yol ise pompa piston hareketinin basınç değişimine göre hareket ettirilerek akışın mekatronik olarak kontrolüdür. Bütün bu mekanik temel olarak 3 pompa türünde de bulunur. Pompalarda farklılık yaratan durum mevcut farklı mobil fazları karıştırma yeteneklerine göre üretilmeleridir (3).
İzokratik (Tek Kanallı) Pompalar
Bu pompalar tek kanallı yani sadece tek bir çözgen ya da çözgen karışımını sürekli olarak hareketli faz olarak besleyen en basit pompa sistemleridir. Eğer uygulama, analiz süresi boyunca birden fazla mobil fazın değişimli karışımını programlamayı gerektirmiyorsa, analiz boyunca sabit konsantrasyonlu bir karışım beslemesine ihtiyaç var ise en ekonomik çözümdür (3).
Tek dezavantajı hazırlamış olduğunuz hareketli faz her seferinde oranı dikkatli biçimde hazırlanmış bir karışım olmalıdır. Böylece analizlerdeki çıkış zamanları (tanımlamalarda çok önemli olan) değişmez ve tekrarlanabilirlik sağlanmış olur. Bu aynı zamanda bekletilmiş karışım halindeki organik fazların oranları da değişeceği için, her gün yenilenmelerini gerektirebilir. Çünkü özellikle organik solvent içeren karışımlarda kolayca buharlaşmalar meydana gelebilir (3).
3.2. İkili (Binary) Pompa Sistemleri
Bu pompa türü temelde iki adet pompa başından oluşur. Her bir pompa başı farklı bir hareketli fazı sisteme basar ve pompa başlarından sonra yüksek basınç altında istenen hareketli faz karışımı çok düşük bir ölü hacimde elde edilir (3).
Ölü hacmin düşük olması, karışım yapan pompalar için özellikle çok düşük akışlı analizlerde önemlidir. Çünkü programlanan konsantrasyon değişimleri çok kısa sürelerde kolona aksettirilebilir ve bu da ayrımın kontrolü ve etkinliğini arttırır. Dolayısı ile günümüzde 1.7 mikron dan daha düşük parçacık boyutuna sahip olan kolonlarla yapılacak analizlerde bu tip pompalar daha çok tercih edilir (3).
Şekil 4. İkili (Binary) Pompa Sistemi
3.3. Gradyen (4 Kanallı (quaternary)) Pompa Sistemleri
Tek bir pompa başından oluşur. 4 değişik hareketli fazı istenen oranda karıştırma, programlama ya da ayrı ayrı kullanma şansı verir. Pompa başından önce konuşlandırılmış 4 kanallı elektronik olarak kontrol edilebilen ve programlanabilen bir dörtlü düşük basınçta karıştırma vanasına sahiptir. Pompa başından önce bulunduğu için ölü hacim genellikle çok yüksektir ve özellikle düşük akışlarda metot geliştirme işleri için uygun olmayabilir (3).
- Bu üç pompa sisteminden analize en uygun bir tanesi ya da hibrit bir pompa minimum analiz gereksinimleri, ekonomik koşullar ve analiz sayıları da göz önünde bulundurularak seçilmelidir.
Şekil 5. Gradyen (4 Kanallı (quaternary)) Pompa Sistemi
4. YÜKSEK BASINÇ POMPA SİSTEMLERİNDE ÇIKABİLECEK ARIZALAR ve ÇÖZÜMLERİ
4.1. Basıncın Yükselmemesi (Pompanın Sıvı Basamaması)
Bunun en genel sebebi sistem içinde çok fazla hava olmasıdır ki hemen her pompanın bir tahliye vanası (Purge Valve) vardır bu tahliye vanası açılıp, gerekli hareketli fazın pompa başı girişine kadar geldiğinden emin olunup (böyle değil ise pompa başı girişi el yordamı ile sökülüp geniş hacimli bir şırınga ile sıvı çekilir ve tekrara takılır.) sistem çalışabileceği en yüksek basma hızına çıkarılıp birkaç dakika çalıştırılır. Daha sonra tekrar normal akış değerlerine getirilip vana kapatılır.
4.2. Dalgalanan Basınç Değeri
Bu problemin nedeni ise pompada biriken tuz kalıntıları olabilir. Özellikle tampon çözeltiler kullanılarak hazırlanan çözeltiler kullandığında pompalar analiz sonunda uygun çözeltilerle iyice yıkanmaz ise bu birikmeler meydana gelir.
Bu tuzlar pompa başındaki akışın tek yönlü olmasını sağlayan vanaların iç mekanizmalarını bozar ve bu vanalar sıvının geri kaçmasına engel olamaz. Bu durumda büyük basınç dalgalanmaları ve akışta kontrolsüzlük yaşanır. Çoğu yazılım bu durumu kontrol ettiğinden analize izin vermez. Bu tuzu çözebilme yeteneğine sahip sıvılar hareketli faz ile değiştirilip pompa çalıştırılarak tuz iyice arınana kadar sitem yıkanmalıdır ya da vanaları, bağlantı noktaları sökülür. Ardından sıcak su ve IPA’ da tutularak; degaze edilir.
Bir başka sebep de damper ya da buna benzer vazifeyi üstlenmiş basınç ve akış regülasyonu sağlayan parçaların arızasıdır ki ilk çözüm iş görmezse bu parçaların değişimi gerekebilir.
Yüksek basınç contalarının yıpranması veya pistonlardaki çizikler de bu tür basınç dalgalanmalarına sebep olabilir ancak bu tür problemler gözle görülebilecek kaçaklara da sebep olduğu için kendilerini hemen ele verirler. Çözüm bu sarf parçaların gerektiğinde ya da laboratuvar politikasına göre bakımdan bakıma değiştirilmesidir.
5. NUMUNE ENJEKSİYON SİSTEMLERİ
Numuneler; HPLC’ye enjeksiyon ünitesinden enjekte edilir. Enjeksiyon ünitesi basit olarak bir enjeksiyon valfi ve örnek haznesinden oluşur. Örnek Enjeksiyon öncesi hareketli fazda çözülerek bir şırınga ile valften enjekte edilir (5).
Örnekleme sistemleri; kolona gönderilmesi gereken analitlerin çok yüksek basınç altında akış ve basınç koşullarını değiştirmeden sağlıklı bir biçimde enjekte edilmesini sağlar. Bu yüzden pompaların çıkabildiği en yüksek basınç limitlerine kadar sızdırmadan çalışabilecek şekilde tasarlanmış olmalıdırlar. Tabii ki bunu yaparken de bir önceki örneklemeden herhangi bir kalıntıyı bir sonraki örneklemeye taşımamaları da gerekir. HPLC örnekleme sistemlerinin iki tipi vardır. Birincisi; ekonomik olan manuel örnekleme vanaları. İkincisi ise oto örnekleyicilerdir (Autosampler) (5).
5.1. Manuel Enjeksiyon
Manuel Örnekleme Vanaları üzerinde, kılcal kanalların uygun bağlantı elemanları ile takılabileceği 6 adet giriş çıkış bulunur. Bu giriş çıkışlar 1-6 arası sayılarla numaralandırılmıştır. 1 ve 4 numaralar arasına genellikle belli bir hacme sahip, dışarıdan cam bir enjektör ile numune doldurulacak örnekleme halkaları takılır. 2 numaralı girişe pompadan gelen hareketli fazı taşıyan kılcal boru, 3 numaralı çıkışa da kolona, hareketli faz yardımı ile analiti taşıyacak olan kılcal boru takılır. 5 ve 6 numaralı kanallar ise atık boruları takılır ve yapılan enjeksiyonun örnekleme halkasından fazla olan miktarı bu kanallardan vananın pozisyonuna göre atılır (5).
Şekil 6. Çeşitli Hacimlerde Örnekleme Halkaları
Örnekleme halkalarının hacimleri sabittir ve analizin gerektirdiği miktara göre hacmi belirlenir. Manuel vanalar genellikle tek bir tip analizin yapıldığı sistemlerle satın alındığı için bu örnekleme halkası sadece bir kez takılır ve o şekilde değiştirmeden çalışılır. Örnekleme halkasının hacminden daha düşük miktarlar da enjekte edilebilir ancak miktar tayini çalışmalarında tekrarlanabilir sonuçlar almak bu şekilde zordur (5).
Örnekleme vanasının iç kısmında bir adet üzerinde 6 adet kılcal kanal bulunan 2 bozuk para kalınlığında teflon bir ara yüz (stator face) ve bu ara yüz kanallarının arasındaki geçişi düzene sokan ve üzerinde teflon ara yüzdeki kanallarla örtüşecek iki ya da üç adet çizgileri olan, çalışılacak asitlik derecesine uygun olarak "vespel" ya da "tefzel" den üretilmiş rotor contası bulunur. Teflon ara yüz sabit, conta ise örnekleme pozisyonunu belirlemek için hareketlidir (5).
Şekil 7. Vana Pozisyonuna Göre Akış Bağlantıları
Şekil 8. Manuel Enjeksiyon Gösterimi
Örnekleme vanasının temel iki adet pozisyonu vardır:
1.Yükleme"LOAD"
2. Enjeksiyon"INJECT"
Yükleme konumunda iken vananın ortasındaki yükleme deliğinden örnekleme halkasından fazla hacmi olan bir enjektör yardımı ile numune yüklemesi yapılır. Numune fazlalığı 5 numaralı kanaldan atılır. Bu konumdayken hareketli faz 2 no'lu kanaldan vanaya giriş yapıp ve 3 numaralı kanaldan direkt kolona gitmektedir. Numune yüklemesi yapıldıktan sonra vana kolu Enjeksiyon konumuna getirilir. Bu durumda 2 ve 3 no’lu kanallar arası kapatılmış, 1 ve 2 ile 3 ve 4 arasındaki kanallar açılmış olur.
Böylelikle; 2 numaralı girişten gelen hareketli faz 1 numaralı kanala gelerek numuneyi örnekleme halkasından sürükleyerek 4 numaralı ve 3 numaralı kanallardan geçerek kolona gider böylelikle analiz işlemi başlatılmış olur (5).
Manuel örnekleme vanalarında zamanla en çok yıpranan parça rotor contasıdır. Dolayısı ile periyodik bakımlarda kontrol veya değişimi yapılması gereken en önemli parça budur (5).
Şekil 9. Manuel Örnekleme Vanasının Açık Hali
5.2. Otomatik Örnekleme Sistemleri
HPLC sistemlerinde otomatik örnekleyiciler rutin çalışan laboratuvarlarda en çok tercih edilen seçenektir. Çünkü, bu sistemler yardımı ile, önceden belli bir listeleme şeklinde tanımlamaları yapılan örnekler otomatik olarak tek tek analizlenmek üzere sistemin bütünüyle bağlantılı bir biçimde çalışılabilir. Oto örnekleyiciler; istenen miktardaki numuneyi (marka ve modelin kapasitesi ile bağlantılı olarak) programlanabilen bir şekilde siteme verebilirler (5).
Bunun yanında bazı kimyasal karışımları istenen biçimde yapıp" türevlendirme" gibi işlemlerde kolaylık sağlayabilirler. Aynı zamanda farklı türde analizlerin aynı sıralama(sekans) içinde tanımlanması ve yapılmasına da olanak tanırlar (5).
Şekil 10. HPLC Autosampler
Oto örnekleyiciler mekanik olarak üç kısımdan oluşur;
1. Örnekleme miktarına bağlı olarak yapılandırılmış tepsi; adreslendirilmiş odacıklardan oluşur. Bu odacıklara ön işlemlerden geçirilmiş numunelerin konulduğu özel küçük şişeler konur. Bu genellikle 2 ml kapasiteli vial diye adlandırılan numunenin kimyasal özelliklerine göre etkileşim oluşturmayacak şişeciklerdir (5).
Cihaz tasarımına göre bu vial tepsileri adreslemesi yapılan numuneye ulaşabilmek için hareketli ya da sabit olabilir.
2. Örneklemeyi yapacak olan iğne ve konsantrik şırınga; belirlenmiş adresteki vialden belirlenen miktardaki numuneyi çekip iletmekle görevlidir. Yine tepsi kısmında olduğu gibi yapılandırmasına bağlı olarak iğne kısmı hareketli ya da sabit olabilir (5).
3. 6 kanallı vana; konsantrik şırınga aracılığı ile çekilen numuneyi bir örnekleme halkasına doldurur. Hemen hemen manuel örnekleme vanaları gibi çalışır (5).
Bu bahsi geçen üç kısım, birbirine entegre biçimde çalışan çeşitli adımlı ve aç- kapa motorlar ile donatılmıştır. Bu motorlar uygun bir elektronik kart ve iç yazılımla birbirine uyumlu biçimde belli bir ahenkle çalışır ve örneklemeyi yapar. Sistem tamamı ile robotiktir. Bu yüzden kalibrasyonu belli periyotlarda kontrol edilmelidir.
Oto örnekleyicilerde en çok rastlanan problemler genellikle hareketli parçaların bulunduğu iğne, iğne oturağı, şırınga ve vana contasında zaman içinde kaçak olarak kendini gösterir. Bu parçaların değişimi sık (örn. 6 ayda 1 kere) olabileceği ve analizlerde kesintiye sebebiyet verebilmesi muhtemel olduğu için gerekli sarfların yedekte bulundurulması iyi bir tedbir olacaktır.
Diğer yandan iğne vial konumlaması yazılımla desteklenen bir uygulama olduğu için bunun da muhakkak belli periyotlarda kontrolü gereklidir.
Diğer yandan iğne vial konumlaması yazılımla desteklenen bir uygulama olduğu için bunun da muhakkak belli periyotlarda kontrolü gereklidir.
6. KOLON SİSTEMLERİ
Kolon (Sabit Faz) maddelerin kimyasal ve fiziksel özelliklerinden yararlanarak birbirlerinden ayırt edilmesini sağlar. Genellikle çelik, PEEK (Polyether Ether Ketone) ve camdan imal edilerek içi belli ölçülerde sabit fazla doldurulur (Silika veya polimer gibi) (6).
Kolon Fırını ise kolonu saklamak ve sabit sıcaklıkta tutmak için kullanılır. Blok ısıtıcılı, fanlı ve Peltier kolon fırınları mevcuttur. Peltier sistemler çok çabuk ısıtılıp soğutulabildiği ve daha stabil sıcaklık sağladığı için tercih edilir.
Kaçak sensörlü (leak sensor) ve multi kolon teknolojili olanları da mevcuttur.
Kolonlar genellikle fonksiyonel grup eklenmiş silika veya polimer bazlı dolguludur. HPLC’nin hayata geçmesiyle kullanılmaya başlanan silika bazlı kolonlar artık yerini yavaş yavaş hızlı analiz yapabilen mikro ve nano gözenekli polimer bazlı kolonlara bırakmaya başlamıştır (6).
Polimer kolonlar silika bazlı olanlara göre ortalama 3 kat daha uzun ömürlüdür ve rejenere edilebilir. Kullanılan mobil faz, sabit faz (kolon) ve moleküler etkileşim türlerine göre HPLC teknikleri aşağıdaki temel gruplarda toplanabilirler;
6.1. Normal Faz Kromatografi
- Sabit faz polar (Silikajel-Polimer ve üzerine bağlanmış –CN, -NO2 veya NH2 dolgu maddeleri)
- Mobilfaz non-polar ya da düşük polariteye sahip (Etileter, Kloroform, Hekzan vb. çözücüler ve karışımları)
Düşük polariteye sahip analit kolondan ilk çıkar. Benzer özelliklere sahip maddelerin birbiri içinde dağılma özelliği yüksek olduğu için düşük polariteye sahip analit mobil fazda çok iyi çözünür ve kolondan ilk önce çıkar. Ayrıca yine aynı özellik sebebiyle apolar analit polar sabit fazla az etkileştiğinden dolayı kolonda kısa süre tutunabilir.
Alıkonma zamanını kısaltmak için mobil fazın polaritesi azaltılır. Alıkonma zamanını arttırmak için mobil fazın polaritesi artırılır.
6.2. Ters Faz Kromatografi
- Sabit faz apolar ( Silikajel-Polimer ve üzerine bağlanmış C18, oktil veya fenil grupları, metil, etil ve –NH2 gruplu dolgu maddeleri)
- Mobilfaz polar (Metanol, Asetonitril, Tetrahidrofuran gibi güçlü organik çözücülerin zayıf çözücü olan sulu veya tamponlanmış, pH ayarı yapılmış karışımları)
Yüksek polariteye sahip analit kolondan ilk çıkar. Benzer özelliklere sahip maddelerin birbiri içinde dağılma özelliği olduğu için yüksek polariteye sahip analit mobilfazda çok iyi çözünür ve kolondan ilk önce çıkar. Ayrıca yine aynı özellik sebebiyle polar analit apolar sabit fazla az etkileştiğinden dolayı kolonda kısa süre tutunabilir.
Alıkonma zamanını kısaltmak için mobil fazın polaritesi azaltılır. Alıkonma zamanını arttırmak için mobil fazın polaritesi artırılır.
- Normal Faz Kromatografide düşük polariteye sahip mobil fazda alıkonma zamanları uzun, polaritesi arttırılmış mobil fazda alıkonma zamanları kısadır.
- Ters Faz Kromatografide yüksek polariteye sahip mobil fazda alıkonma zamanları uzun, polaritesi azaltılmış mobil fazda alıkonma zamanları kısadır.
6.3. İyon Değiştirme Kromatografisi
- İyonik bileşikleri ayırmak için kullanılan bir tekniktir. Ayrıca suda çözünen organik maddelerin analizinde de kullanışlıdır (6).
- Katyonlar için negatif yüklü fonksiyonel gruplu dolgu maddeli kolonlar, Anyonlar için pozitif yüklü fonksiyonel gruplu dolgu maddeli kolonlar kullanılır (6).
- İyonun molekül ağırlığı arttıkça kolonda tutunma gücü de artar.
6.4. Size Exclusion (Eleme) Kromatografisi
- Molekül ağırlıkları farkı çok büyük olan analitlerin bir arada analiz edileceği karışımlar için kullanılan bir tekniktir (6).
- Bu teknikte analitler ve kolon dolgu maddesinde kimyasal değil fiziksel bir etkileşim vardır. Büyük molekül ağırlığı olan analit kolon dolgu maddesindeki porlara sığmadığı için kolonu önce terk eder (6).
- Genellikle polimer, şeker ve protein analizlerinde kullanılır.
- Eleme tekniğinde kullanılan mobil faz organik çözücü ise GPC (Gel Permeation Chromatography), sulu çözelti ise GFC (Gel Filtration Chromatography) adını alır (6).
6.5. Chiral Ayırma
Fiziksel özellikleri aynı olan izomerlerin sabit fazla etkileşime girip izomer çifti olan diastereomere dönüştürülerek özel chiral kolonlar kullanılarak yapılan bir tekniktir (6).
7. KAYNAKÇA
(3) - http://okanongan.blogspot.com.tr/2015/01/hplcyuksek-performans-sv-kromatografi.html, (E.T. 25.04.2017)
(4) - http://docplayer.biz.tr/13047870-Hplc-yuksek-performansli-sivi-kromatografisi.html, (E.T. 25.04.2017)
(5) - http://okanongan.blogspot.com.tr/2015/01/hplcyuksek-performans-sv-kromatografi_24.html, (E.T. 25.04.2017)
(6) - http://gidaarge.akdeniz.edu.tr/cihazlar.i32.yuksek-performansli-sivi-kromatografisi-hplc-, (E.T. 25.04.2017)
8. ŞEKİL LİSTESİ
Şekil-1. Sıvı kromatografinin uygulamaları.
Şekil 2. HPLC Cihazının Kısımları
Şekil 3. Temel Pompa Sistemi
Şekil 4. İkili (Binary) Pompa Sistemi
Şekil 5. Gradyen (4 Kanallı (quaternary)) Pompa Sistemi
Şekil 6. Çeşitli Hacimlerde Manuel Örnekleme Halkaları
Şekil 7. Vana Pozisyonuna Göre Akış Bağlantıları
Şekil 8. Manuel Enjeksiyon Gösterimi
Şekil 9. Manuel Örnekleme Vanasının Açık Hali
Şekil 10. HPLC Autosampler
Konu anlatımı çok guzel teşekkürler. Fakat resimler(sekil) acilmiyor.
YanıtlaSil