Hızlı Santrifüj Ayırma Kromatografisi ( Fast Centrifugal Partition Chromatography) (CPC)
- Karşı akım kromatografisinin çeşitli tekniklerinden biridir (Merkez kaç kuvveti ile tutulan sabit fazın kullanıldığı, katı bir destek olmaksızın iki karışmaz sıvı fazın kullanıldığı sıvı-sıvı kromatografik bir yöntemdir.) [1].
- Santrifüj ayırma kromografisi ayrıca hidrostatik karşı akım kromatografisi olarak da bilinir [1].
- Tek bir dönme ekseni çevresinde dönen kolonun dönme hareketini prensip olarak almıştır [1].
Sıvı Sıvı Kromatografisnin Faydaları
- Katı bir desteği bulunmaz ve bu sayede solvent tüketimi katı desteği bulunan sisteme göre solvent tüketimi yaklaşık 10 kat azalır [2].
- Katı faz dolu kolonda gerçekleşebilecek geri döndürülemez adsorpsiyona karşı önleyici yöntemdir [2].
- Degredasyona meyilli olan hassas moleküllerin %90’a varan oranlarda elde edilebilir. Verim yüksektir [2].
- Bileşiklerin fazlar arasında yer değiştirmesiyle gerçekleşebilecek verim kaybının önüne geçilir[2].
- Kolay kullanım ve ölçüm almaya yatkındır [2].
- Hemen hemen her türdeki bileşiğin, inorganik iyonlardan herhangi bir organik moleküle, hatta büyük molekül ağırlıklı proteinlere kadar ayrıştırılmasına izin veren geniş kapsama sahiptir [2].
CPC’nin Çalışma Prensibi
Santrifüj Ayırma Kromatografisi sıvı-sıvı kromatografik yöntemdir. İki karışmayan sıvı birbiriyle iki fazlı bir sistem oluşturmak üzere birbiriyle karıştırılır. Daha sonra birden çok kez ayrılmalar gerçekleştirilerek saflaştırmalar yapılır. Bu iki fazlı sistemde her bir bileşiğin farklı dağılma katsayılarına dayalı olarak ayrı ayrı bileşikler izole edilir [3].
Bu iki fazlı sistemin sıvı fazlarından biri sabit sıvı faz olarak kullanılır ve kolonun dönmesi sırasında mobil faz ona beslenir [3].
Sabit faz üretilen santrifüj kuvveti vasıtasıyla kolayca rotorun içinde tutulur. Hücreler önce sabit faz olarak seçilen sıvı ile doldurulur. Bununla birlikte tasarım, mobil fazın bir karıştırma bölümünden diğerine geçmesine izin verir. Enjekte edilen numune, bu bölmelerden geçer ve her biri için, ayırma hunisinde olduğu gibi, iki faz arasındaki numunenin bileşenleri ayrılır.
Bir hareketli faz rotora pompalanırken, ayırmanın gerçekleşmesi için devir sayısı yüksek bir seviyeye yükseltilir [3].
İki faz arasında denge kurulduğunda numune enjekte edilir ve çözücüler, ayırma hunisinde yaptığı gibi fazlar arasında ayrılmaya başlarlar. Bileşenler iki faz arasında farklı şekilde ayrıldığından, mobil faz en küçük bölüm katsayılarına (p = [c] sabit faz / [c] mobil faz) sahip bileşenleri daha hızlı gerçekleştirecektir.
Bu nedenle ilk önce ayrıştırılacak bileşen, mobil faza en iyi bölünen bileşendir. Rotordan çıkışta, çıkan mobil faz, uygun bir dedektör ve/veya fraksiyon toplayıcısına yönlendirilir.
İki fazlı sistemin diğer fazı olan mobil faz ekstrakte edilecek çözeltileri içerir. Basınç altında rotor içine beslenir ve sabit faz boyunca pompalanır [3].
Hareketli fazın akışına giren numune Stokes yasasına göre atomizasyona uğrar ve küçük damlacıklar oluşturur. Bu damlacıklar, durağan fazdan geçer ve ekstraksiyon olarak adlandırılan yüksek bir arayüz alanı oluşturur. Hücrelerin sonunda bu damlacıklar yüzey gerilimi nedeniyle birleşir [3].
Hareketli ve sabit fazların ayrılmış fraksiyonları birkaç dakika ile birkaç saat arasında toplanır. Bu fraksiyonlar veya eluatlar, ayrı şekilde saflaştırılmış maddeleri içerecektir (3).
Elute Etmek: Bir maddeyi solventle diğerinden ayrıştırmayı sağlayan ayrıştırma yöntemidir. Bahsedilen rotor sayısı; sürece bağlı olarak değişen birkaç ikiz hücreli diskten oluşur.
Şekil 1. CPC Sisteminin Genel Mekanizması Gösterimi.
Uygulama Teknikleri
Seçilen çözücü sistemine bağlı olarak, CPC iki mod çalışılabilir;
1. Azalan mod: Bu modda çalışırken, daha ağır sıvı fazı mobil fazdır ve daha hafif olan durağan faz boyunca ilerlemektedir. Bu aynı zamanda hafif faz sürekli ekstraksiyon sistemi olarak da bilinir [3].
2. Artan mod: Artan modda çalışırken, daha hafif sıvı faz mobil fazdır ve durağan ağır faz içinden geçer. Bu aynı zamanda ağır faz sürekli ekstraksiyon sistemi olarak da bilinir ([3].
Şekil 2. CPC Sisteminin Kolonunun Çalışma Prensibinin Şematik Gösterimi.
Uygulama Alanı
- Preparatif bir kromatografi tekniğidir [4].
- Her tür ayrıma uyarlanmış tek bir rotor (Rotor ayrılacak bileşiklere göre özelleştirebilir.) [4].
- Doğal eksratlardan, sentetik karışımlardan veya biyolojik matristen ayrıştırılan moleküllerin saflaştırılmasına olanak sağlar (%99,5 oranında safsızlık ) [4].
- Oldukça karmaşık yapıya sahip ham özütlerin saflaştırılmasını sağlar [4].
- Çok geniş aralıkta polariteye sahip moleküllerin ayrışmasında etkindir [4]. Silica ya da diğer dolgu malzemeleriyle etkileşime girebilecek hassas moleküllerin denatürasyonu gerçekleşmez [4].
- Geniş madde miktarı aralığında ayrıştırmayı sağlar (mg'dan birkaç kg'a kadar olan numunelere uyarlanmış tek bir ayırma / saflaştırma tekniği) [4].
- Bu kromatografik teknik ayrıca reaksiyon izlemeleri için de kullanılır. Tersine çevrilebilir bir tepkimenin dengeye kaymasını sağlayabilir. Tepkimeler durağan fazda gerçekleşirken, ürünler mobil faza ayrılır. Ürünlerin kromatografik ayrımı, üretimle aynı anda gerçekleştiğinden ters reaksiyon engellenir. Bu nedenle, termodinamik denge ötesinde reaksiyonlar elde edilir [3].
Şekil 3. CPC Sisteminin Uygulanabileceği Moleküller ve Solvent Sistemleri.
Maliyet Etkisi
- Düşük solvent tüketimi sağlar. (Diğer yöntemlere oranla %10-25 daha az)
- Geri döndürülemez adsorpsiyon ile birlikte oluşabilecek madde kayıplarının önüne geçilir [4].
- Muadillerine göre 3 ila 5 kat daha hızlıdır. Zaman kazanımı gerçekleşir [4].
6. Avantajlar ve Dezavantajlar
Preparatif Ölçekli Kağıt Kromatografisinde Ana Problemler
- Kağıt Kromatografisi uzun mesafeli bir ayırma yöntemidir (Ayırmanın gerçekleşmesi için uzun bir sabit faz gerekir.) [2].
- Ayrılabilen madde miktarının kısıtlı olması [4].
- Kesintili ayrım gerçekleşir. Sürekli bir kromatografik ayrışmanın gerçekleşmesi neredeyse imkansızdır [5].
- Yöntem sadece analitik amaçlar için uygundur. Preparatif ayırma işlemini gerçekleştirmede çok etkilidir. Ancak belirtildiği üzere ayırma işlemi için gereken süre uzundur [2].
Santrifüj Alanında Preparatif Ölçekli Kağıt Kromatografisi uygulamasında numune bir kılcal tüp vasıtasıyla hareketli faz girişine yakın olan kromatografik kağıdın dönen diskine sürekli olarak yatırılır.
Spiralin gidişini takip eden bir sonraki faktör, kılcal borunun; kromatografik kağıt diskine göre hareket hızıdır (2).
Flash Kromatografisi ve HPLC Yönteminde Ana Problemler
Flash Kromatografisi ve HPLC Yönteminde Ana Problemler
- Santrifüj yönteminin, yüksek kütle ve hacim yüklemeleri ile iki fazlı çözücünün sonsuz seçime yakın olması düşük çözünürlük etkisini büyük ölçüde azaltması, Flash/HPLC’ de uygulanamaz ve dezavantajdır [2].
- HPLC’de olduğu gibi Santrifüjlü Ayırma Kromatografisinde katı faz yoktur ve maliyet böylece düşer [2].
HPLC Hızlı Santrifüj Kromatografisi (CPC)
%75 Mobil Faz %25 Mobil Faz
%5 Sabit Faz %75 Sabit Faz
%20 Silika Desteği
HPLC ve CPC kolonlarında veya rotorunda sabit fazdan mobil faza farklı oranlar gösterilebilir.
7. CPC’ nin Diğer Avantajları
- HPLC veya Flash Kromatografisi gibi klasikleşmiş saflaştırma tekniklerine bir alternatiftir [2].
- Diğer yöntemlere nazaran daha ekolojik bir yöntemdir.
- Yalnızca iki fazlı bir solvent karışımı gerektirdiğinden dolayı çözücü sisteminin yapısının değiştirilerek bileşiklerin farklı olarak dağılma katsayılarına göre ayrılmasını sağlamak mümkündür [3].
- Üretim ölçeği.
- Çok yüksek akış hızları (örneğin 10 litre / dakika) elde etmek mümkündür.
- Diğer endüstriyel aletler, ayda 10 kg'dan tona kadar olan materyalleri arıtabiliyor olmakla birlikte, en çok litrelik / dakika akış hızlarına sahiptir [1].
- Sıralı karıştırma çöktürme aşamaları sırasında hedef kademeli olarak ayrılır. Saatte 100.000’ den fazla karıştırma-çöktürme döngüsü gerçekleşir [1].
- Teorik plaka sayısı çok yüksektir [3].
- Numuneye ve ayrılacak olan bileşiklere göre özel dedektörler bağlanabilir [3].
8. Kaynaklar
- Centrifugal partition chromatography, (2017), Wikipedia, https://en.wikipedia.org/wiki/Centrifugal_partition_chromatography, (ET: 06.03.2017).
- Counter current chromatography can greatly enhance both your research and process productıon, AECS Quikprep, http://www.quattroprep.com/CPC_Partitron.html, (ET: 06.03.2017).
- G. Mahesh Kumar, (2014), Centrifugal Partition hromatography: An Overview, International Journal of Pharmaceutical Research & Analysis, (6), 353-360.
- Miroslav Pavlicek, Jan Rosmus, Zdenek Deyl, (1962),V. Apparatus For Preparative-Scale Paper Chromatography in The Centrifugal Field, Journal of Chromatography, (10), 497-501.
9. Şekiller
Şekil 1. CPC Sisteminin Genel Mekanizması Gösterimi, https://www.researchgate.net/profile/Yoichiro_Ito/publication/11856128/figure/fig1/AS:281961001177088@1444236149374/Fig-2-Schematic-drawing-of-the-centrifugal-precipitation-chromatography-system-used-in.png, (ET: 06.03.2017).
Şekil 2. CPC Sisteminin Kolonunun Çalışma Prensibinin Şematik Gösterimi, http://www.labx.co.kr/mall/images/Fg21Dr_FC.gif, (ET: 06.03.2017).
Şekil 3. CPC Sisteminin Uygulanabileceği Moleküller ve Solvent Sistemleri
